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ATCC细胞培养,你需要这份指南

发布时间:2019-08-15 阅读:264

    细胞培养是需要花费一定的精力的,还要有一定的耐心。谁培养细胞没有失败呢!总是会出现或多或少的问题,ATCC细胞培养,你需要这份指南!
    一、复苏程序
    1、准备细胞培养容器(如T-75细胞瓶),加入至少10 ml适当的培养基,并平衡温度及pH。
    2、从液氮罐中取出冻存管,并在37℃(或适合该细胞的温度)水浴中缓慢摇动至冰晶彻底融化(约2 min),注意解冻过程要迅速。
    3、从水浴中取出冻存管,浸泡或者喷撒酒精消毒。后续的操作,需在无菌操作台中,并保证严格无菌。
    4、拧开冻存管盖,将细胞悬液转移至含有9ml完全培养基的无菌离心管中。温和离心(125g×10min),弃去上清去除冻存保护剂。注意不要扰动细胞层。加入1-2 ml完全培养基重悬细胞,缓慢吹打使细胞团变松散。将细胞悬液转移至含培养基的容器中充分混合。
    5、24小时后,检测细胞状态。
    注:细胞复苏时,应以zui快速度融化冻存的细胞溶液,然后迅速与完全培养基混合,并接种到合适的细胞瓶中。
    二、细胞传代培养
    1、单层贴壁细胞
    为了保证单层贴壁细胞的对数生长,需要定期传代。当细胞生长接近指数生长后期(汇合率大约70%到90%),准备传代。针对传代过程,ATCC提供的产品说明中,会推荐细胞传代分配比例和补充培养基策略。
    单层贴壁细胞传代,需要打断细胞之间的连接。对于比较松散的连接,猛击培养瓶侧壁,可以分离细胞。很多情况下,需要胰蛋白酶/EDTA的蛋白水解酶来消化。对于一些细胞系,需要采用刮等机械方法分离细胞。细胞分离成为单细胞悬液后,稀释到适当的密度并转移到新的培养瓶中,在适当的生长培养基中,细胞将再贴壁生长和分裂。
    由于每种细胞都是的,孵化时间和温度、清洗次数或溶液配方可能会有所不同。分离过程中,应用显微镜密切观察细胞,以防止细胞损伤。这个过程根据容器使用合适的培养体积。
    2、悬浮细胞
    相对于单层贴壁细胞来说,悬浮细胞的传代更具有,单层贴壁细胞需要蛋白水解酶,会造成细胞损伤。而悬浮细胞可以使用稀释的方法来传代,细胞生长没有延迟,对实验室空间要求较小,传代培养是线性放大的。比如细胞可以在发酵罐中培养。 
    根据细胞类型,悬浮培养接种密度从2×10^4至5×10^5活细胞/ml。收获时细胞密度2×10^6细胞/ml。如果细胞接种密度过低,他们将经历增长延迟阶段,增长非常缓慢甚至完全死亡。如果细胞密度过高,细胞可能耗尽培养基中营养,而突然死去。
    三、冻存程序
    1、冻存前先检测细胞是否受到细菌、真菌、支原体和病毒的污染。如果确定有污染,应将该细胞销毁。
    2、冻存培养基由完全培养基和5%DMSO组成。由于DMSO的溶解会放热,所以不能向细胞悬液中直接加入未稀释的DMSO。
    3、以温和速度(125g×10 min)离心收集细胞,并以1×10^6-5×10^6活细胞/ml的密度重悬细胞。
    4、在冻存管上标记好细胞名称,编号和冻存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml细胞悬液(视冻存管体积)并密封。
    5、室温条件下,将细胞在冻存培养基中平衡15-40 min(勿超)。这段时间中,可以将细胞悬液等分加入冻存管中。
    6、将冻存管置于已预冷至4℃的程序降温盒,之后置于-70℃(或更冷)的冰箱中至少24小时。或者使用已预冷至4℃的可编程电子降温系统。
    7、将冻存管迅速转移至液氮罐或者-130℃冰箱。
    8、记录冻存位置和过程细节等信息。
    9、24小时后,取出一只冻存管并复苏,以测定细胞活性和是否污染。
    注:以上程序适用于大多数细胞。冻存培养基的配方请参考细胞说明书。冻存时,细胞应处于指数生长期。







                                                         (本文内容来源于网络,如有侵权请联系删除)

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